紫外—可见分光光度计使用方法

紫外—可见分光光度计使用方法

岛津2401（或2501） UV—VIS分光光度计，是具有自检功能的双光束型仪器。它具有波长自动校正，波长扫描，吸光度和透过率测定、时间程序和多通道运算等多种功能；为了获得可信的测定结果，必须熟悉操作。

1、待测分析样的准备：1）待分析样必须澄清、透明，不容许有沉淀或悬浮物；必要时可用离心、过滤或萃取的方法除去。2）应尽可能使用吸光度较小的试剂作溶剂。3）对大量干扰测定的基体化合物，必须事先除去；4）定量测定，必须设置空白或对照样；5）精确的测定，还必须设置平行样；6）对容易产生冷渾的样品，要注意保温；7）对于容易分解或变化的试样，要严格定時测定；8）测定易挥发性的样品（包括使用了易挥发的溶剂），要使用带盖的比色皿；9）比色皿必须里外清洁、合理选择（玻璃/石英）、配对。

2、开机顺序：PC电源（进入WIN界面）——UV主机电源——双击工作软件图标进入主画面——自检——点灯，光电培增管升压——进入工作界面）——待机。

3、选择测定项目和检测参数：

1）定量测定：在“釆集”菜单中，选择：“定量”；进入相应的工作界面，进入定量参数设置窗口（如上一次退出之前或本次进入之后，已进入定量分析窗口，则不会出现定量参数设置窗；此时，如有保存的设置参数，可以调用。如另行设置，打开旁边的“配置”菜单，点击“参数”项，再行进入）。在“方法”框内的下拉菜单中，选择“原始数据测量”，在跳出的的原始数据测量窗口的测量模式中，选择abs，点击“能量”按钮，选择以下参数：灯：根据待测物的吸收波长，钨灯、氘灯任选；检测器：“光电倍增管”；光电倍增管增益：0—7（增益不要设置过大，以利于延长光电倍增管的寿命）；确定，返回定量参数窗口；继续选择波长、记录方式、狭缝宽度（6档：紫外区、单一化合物，狭缝小一些）、重复测定的次数。如果需要设定浓度单位和范围，可点击“浓度”按钮．确定后退出。确认后返回定量测定界面。

如果要作标准曲线，应在参数设定窗口的“方法”下拉菜单中，选择单点或多点工作曲线，在跳出的窗口中选择曲线的级別（线性为1次曲线）、确定是否进行零点校正及标准浓度等选项。

如果已知计算公式的斜率（K1）和截距（K0），也可在“方法”中选择“K factor”，分别在对应的输入框内输入相关数字，直接根据所测的吸光度进行计算。必要时上述参数应命名保存，备用。如果灯源已关闭，进入"配置"菜单，点击"系统开关"，将仪器打开并选择钨灯或氘灯（注意：在此窗口不要选择“零次光”zero order light，他是为校直微量液槽而设，而且在校直光路时，要阻档白炽光进入光电倍增管；或将光电倍增管关闭）。根据样品和参比物光路的前后，放置比色皿（一般，后面放参比池，前面放样品池；也可在“配置”中的“仪器参数”中，更改前/后）。至此，可以进行定量测定操作。

2）光谱分析：在采集方式中选择光谱模式，跳出光谱扫描参数窗口，供选择的参数有：测量类型（吸收，透过率，反射，光能量），测量范围，波长范围、扫描速度、狭缝宽度、波长间距等，按需要选定。如需重复扫描（用于化学动态变化研究），可在重复扫描参数中选择：重复扫描的次数、每次扫描之间的时间间隔以及存放光谱的文件名（或选定“自动文件”按钮设置）。

3）时间程序（在指定的波长下，每隔一定时间，测定一次光度的变化；主要用于酶学等动态研究）：时间程序参数包括：测量类型、记录范围、检测波长、狭缝的宽度、时间选择方式（自动、手动，在手动方式時“单位”为可选：秒、分和小时）、反应时间、获取比率、读数次数等。

4、使用中应注意的几个问题：

1）在做光谱分析時，不要揿Auto Zero按钮（它是在作定量测定时，为消除微电流漂移而设的）。为了使用空白或试剂校零，在同一波长范围内，只可以使用“基线，baseline”按钮；然而，在狭缝，扫描速度、波长范围、时间间隔中，有任何参数改变，都必须重新扫描。

2）为了操作方便，尽可能采用自定义快捷键方式（可进入speedbox，自定义快捷键，但要注意：所选图标和所选命令要匹配）。

3）比色皿有两个透光面，一旦双光路平衡以后，在同一系列测定使用过程中，不要来回调换；因为两面的折光率等参数不尽相同。

4）仪器配备了多波长工作软件后（灰色时不能使用），可以使用菜单中的“数据处理manipulate”功能：对光谱求导，还可进行光谱通道间的四则运算、峰的检出等。而在定量分析时，可以选定曲线的类型和是否通过原点进行计算。

5)“显示presentation”菜单中，可以设置图形界面的尺寸；设置打印区块；标尺的自动缩放（Radar）；复制谱图；吸光度/浓度转换；通道状态；显示快捷图标等，根据实际选择。

6）仪器配备了测色软件后，可作为色差计使用；满足色度、色饱和度，明亮度等参数的测定。使用方法参见操作手册。

5、 维护与保养

5.1日检查

5.1.1检查冷却风扇

检查UV-2401PC／2501PC主机背面冷却风扇工作情况。如冷却风扇不工作，光源部分的温度将会上升，安全系统(温度保险丝)将烧断，WI灯不能点亮。

5.1.2检查样品室底座

检查样品室底座是否有溢出的液体样品，若有溢出的液体样品，样品蒸气会充满样品室，腐蚀样品室或引起吸收导致错误测定结果。

5.2周期性检查

5.2.1检查样品室的光源入／出射石英窗口是否弄脏(每周)：过脏会直接影响吸光度值。如果有脏物或灰尘引起吸收，向上卸下样品室，拆下固定石英窗板的0型圈，然后取下石英窗板，用一块浸湿酒精的干净布擦净石英窗板。

5.2.2检查光源灯已使用时间(每月)：WI灯和D2灯的平均使用寿命分别为2000小时和500小时。如果光源退化，光能量降低会导致噪声增大。因此，应记录光源的已使用时间，当累计使用时间超过平均使用寿命，测定值波动过大时，应更换光源。

5.2.3 检查波长准确性、基线平坦度、基线噪声及波长重复性(1-2次／每年)：检查波长准确性、基线平坦度、基线噪声及波长重复性。若发现不符合规定指标时，与岛津代表处联系。

5.3波长准确性的检查方法

测定D2灯或低压汞灯发射的特征谱线，将测定结果与D2灯或汞灯的特征谱线波长值比较，检查仪器的波长准确性。

    技术指标：≤±0．30nm(狭缝宽度0．2nm)

    检查步骤：

    D2灯的特征谱线波长：

    486．OOnm

    656．10nm

    设定下述测量参数：

    光谱测量方式

    测定方式    ：Energy

    记录范围    ：0—100

    波长范围    ：490nm-480nm

    扫描速度    ：中速

    狭缝宽度    ：0．2nm

    能量   (Energy)

    光源灯    ：D2(氘)灯

    光电倍增管增益   ：根据信号大小选择适当值。

    单击“Start”

    在“Manipulate”(处理)下拉式菜单中单击“Peak Pick”(检峰)

    检查测定值是否满足技术指标要求。

    仅仅改变如下条件：

    波长范围    ：660nm—650nm

    光电倍增管增益   ：根据信号大小选择适当值。

    重复上述步骤

5.4 基线平坦度的检查方法

不放置任何样品于样品室进行基线校正，然后在开机点亮WI、D2灯、预热30分钟后进行波长扫描，所获得的光谱的平坦度即为基线平坦度。

    技术指标：弯曲≤±0．001Abs(900--190nm)(除噪声外)

    检查步骤：

    (1)设定下述测量参数：

    测量方式    ：吸光度(Abs)

    记录范围    ：-0.005Abs一0．005Abs

    波长范围    ：900nm-190nm

    扫描速度    ：慢速

    狭缝宽度    ：2.0nm

    (2)击“Baseline”进行基线校正。

    (3)单击'GO T0   WL’，设定波长750nm，然后单击"Auto Zero'’(自动调零)。

    单击"Start"(开始)进行基线测定。   

    检查基线平坦度是否满足技术指标要求。

5.5 基线噪声

不放置任何样品于样品室进行基线校正，然后在开机点亮WI、D2灯、预热30分钟后进行波长扫描，在所获得的光谱图的下列波长检查基线噪声。

    技术指标：

         UV-2401PC               UV-2501PC

    900 nm：≤±0.010Abs        900 nm：≤±0．030Abs

    800 nm：≤±0.002Abs        800 nm：≤±0．004Abs

    600 nm：≤±0.0015Abs       600 nm：≤±0．003Abs

    350 nm：≤±0.003Abs        350 nm：≤±0．005Abs

    200 nm：≤±0.005Abs        200 nm：≤±0．015Abs

    检查步骤；

    (1)设定下述测量参数：

    测量方式    ：吸光度(Abs)

    记录范围    ：-0．020Abs一0．020Abs

    波长范围    ：900nm-190nm

    扫描速度    ：慢速

    狭缝宽度    ：2.0nm

    (2)进行基线校正。

    (3)单击”GO TO WL"，设定波长750nm，然后单击"Auto Zero"(自动调零)。

    (4)单击"Start"(开始)记录基线．

    (5)在上述波长下检查基线噪声是否满足技术指标要求。

5.6 波长重复性检查

波长重复性的检查需使用铷玻璃滤光片在400nm与568nm之间透过率的差值大小来进行检查。也可采用氘灯特征谱线(486.0nm或656．1nm)三次重复扫描的峰值波长之差值小于±0．1nm来检查波长重复性。操作步骤见波长准确性检查。

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│   项    目        │    规   定   指   标          │

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│1．基线平坦度检查 │<土0．00labs(除噪声外)      │

│2．波长准确性     │<±0．3nm                   │

│3．波长重复性     │<±0．1nm(透过率偏差<2．5％)│

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